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ddPCR (Droplet Digital PCR) 解析

2016/12/07 掲載

■デジタルPCRとは

 デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べてはるかに高精度高感度に定量を行う新しい技術です。定性のみの通常PCR、検量線による相対定量のリアルタイムPCRに対して、絶対定量を行うデジタルPCRは第3世代のPCRと言われています。

 デジタルPCRはリアルタイムPCRと全くコンセプトが異なり、限界希釈(各微小区画にターゲットDNAが1または0となるような希釈)したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCR増幅を行います。これによってターゲット遺伝子を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり、ターゲット遺伝子を含まないもしくはサンプルDNA自体を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなります。ポジティブの微小区画の数を直接カウントすることでサンプル中のターゲット遺伝子濃度を絶対的に測定します。

 限界希釈したサンプルDNAであっても微小区画あたりの断片数が1以上になる場合があります。これを補正するため、ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出します。ポアソン分布での補正はソフトウェアにより自動的に算出されます。

 ジェネティックラボではドロップレットを自動調製するDroplet Generatorを導入しているため、多検体を再現性良く測定することが可能です。

 

■Droplet Generatorの仕様

機器名
QX200 Droplet Digital PCRシステム
販売会社
バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社
サンプル容量(μL)
20
QX200 Droplet Generator
1ランあたりのサンプル処理数
1 ~ 96 サンプル
サンプル20μLあたりの
ドロップレット数
最大20,000
励起光源
2LED
検出器
MPPC (Multipixel Photon Counters)
検出チャネル
FAM (EvaGreen)、HEX (VIC)
ダイナミックレンジ
5オーダー
精度
±10%
読み取り区画数
10,000以上/サンプル
QX200 Droplet Generator サイズ
(W x D x H)
28 x 36 x 13 cm (11 x 14 x 5")
QX200 Droplet Reader サイズ
(W x D x H)
66 x 52 x 29 cm (26 x 20 x 11")
QX200 droplet reader capacity
1–96 samples

 

■ddPCRの特長

絶対定量
  • 1mLあたりのコピー数
  • 検量線不要
  • エンドポイント測定なので、増幅効率に影響されにくい
高精度
  • 1.1倍希釈系列を判別可能
  • qPCRでは困難な低濃度域での精度が高い
高感度
  • バックグラウンドの影響を減少させて、微量なターゲットを増幅
  • 0.001%オーダーで検出
高処理性
  • 1回のランで96サンプルの測定が可能
  • 低ランニングコスト

 

■デジタルPCRのアプリケーション

  • CNV(Copy Number Variation)
  • Rare mutation / Rare sequence 検出
  • mRNA、 miRNA 定量(高精度定量、低コピー数定量)
  • Single cell など、微量サンプルでの定量

 

■ワークフロー

1. ドロップレットの作成

  • 専用カートリッジに調製したサンプルおよび専用オイルを分注します。
  • カートリッジをセットした後、サンプルを微小区画に分割します。
  • ターゲットDNA()とバックグラウンドDNA()がランダムに分散します。

2. PCR

  • 専用カートリッジの各ウェルで作成したドロップレットを、96ウェルのPCRプレートの各ウェルに移し、シーリングを行います。
  • その後、それぞれの微小区画で個別にPCR反応を行います。

3. ドロップレット蛍光測定およびデータ解析

  • PCR終了後、96ウェルPCRプレートをQX200 Droplet Readerにセットします。
  • 各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し、ポジティブな微小区画の数およびネガティブな微小区画の数を直接カウントします。
  • QuantaSoftソフトウェアを使用し、ポジティブな微小区画の割合からターゲットの濃度(コピー/μL)を算出します。

【バイオ・ラッド社の製品紹介ページ】
http://www.bio-rad.com/ja-jp/category/digital-pcr
https://ls.ipros.jp/advertising/detail/33462/

※セルフリーDNAの解析は、解析用に専用採血管を準備し、全血より血漿の回収から受託いたします。凍結した血清、血漿からの受託も可能です。

 

■使用プローブ

  • リキッドバイオプシーに対応して開発されたプローブが使用可能です。
  • QX200システムに対して開発されたプローブのため、全てワーク確認済みです。
  • Singleplex用のプローブを用いたtypingだけでなく、Multiplex用のプローブを用いたtyping、ホットスポットに対するプローブを用いたScreeningが可能です。
  • 対象がん種に対して薬剤感受性または耐性変異の検出が可能です。変異のモニタリングに最適です。

【変異解析用プローブ】

対象組織 遺伝子 対象変異 検出
Lung ALK p. E17K single
p. T1151_L1152insT single
p. L1152R single
p. C1156Y single
p. I1171T single
p. F1174L single
p. V1180L single
p. L1196M single
p. G1202R single
p. S1206Y single
p. G1269A single
p. L1198F single
p. T1151_L1152insT,
p. C1156Y, p. L1196M,
p. G1269A
multi
p. L1152R, p. F1174L,
p. V1180L
multi
p. I1171T, p. G1202R,
p. S1206Y
multi
EGFR p. L858R single
p. T790M single
p. C797S (c.2389T>A,
c.2390G>C) 
multi
p. G719C/A/S multi
Exon19 Deletion screening
PIK3CA p. E542V/K,
p. E545V/G/A/Q/K,
p. Q546L/R/P/E/K
screening
p. H1047L/R/Y,
p. G1049R/S
screening
ROS1 p. G2032R single
Brest ESR1 p. Y537N single
p. Y537S single
p. D538G single
p. E380Q single
p. Y537N/S, p. D538G multi
p. V534E, p. P535H,
p. L536R/Q/P/H,
p. Y537N/C/S, p. D538G
screening
ESR1/YAP1 fusion expression
PIK3CA p. E542V/K,
p. E545V/G/A/Q/K,
p. Q546L/R/P/E/K
screening
p. H1047L/R/Y,
p. G1049R/S
screening
Melanoma BRAF p D549G/N, p. K601E,
p. V600E/K/R/G/M/D
screening
NRAS p. Q61R/K/L?H/P/E,
p. E62K
screening
MEK1 p. C121S, p. P142S/L,
p. G128V/D, p. F129L
screening
Other AR AR v7 expression
EGFR p. S492R (c. 1474A>C) single
EGFR p. S492R (c. 1476C>A) single
SMO p. D473H single

【CNV解析用プローブ】

対象遺伝子 reference 
AKT1 CTNNB1 IGF2R AP3B1
AKT2 EGFR KIT APOB
ALK ESR1 KRAS AQP5
AR FGFR1 MEK PMP22
BRAF FGFR2 NRAS RPP30
CCND1 FGFR3 PDGFRA TOP3A
CDK4 HER2 PIK3CA -
CDK6 IGF1R VEGFR
cMET -

 

※表にないターゲットについても対応可能な場合がございますので、ご検討内容をお問い合わせください。

 

■ddPCRに関連する論文

ddPCRを用いた論文をご紹介いたします。

キーワード: Cancer ・Mutation Detection ・Liquid Biopsy
【2015】
Improved sensitivity of circulating tumor DNA measurement using short PCR amplicons. Andersen RF et al. Clin Chim Acta. 2015 Jan 15;439:97-101. doi: 10.1016/j.cca.2014.10.011. Epub 2014 Oct 20.
 
Filtration Device for On-Site Collection, Storage and Shipment of Cells from Urine and Its Application to DNA-Based Detection of Bladder Cancer. Andersson E et al. PLoS One. 2015 Jul 7;10(7):e0131889. doi: 10.1371/journal.pone.0131889. eCollection 2015.
 
Detection of tumor ALK status in neuroblastoma patients using peripheral blood. Combaret V et al. Cancer Med. 2015 Apr;4(4):540-50. doi: 10.1002/cam4.414. Epub 2015 Feb 4.
 
Noninvasive detection of activating estrogen receptor 1 (ESR1) mutations in estrogen receptor-positive metastatic breast cancer. Guttery DS et al. Clin Chem. 2015 Jul;61(7):974-82. doi: 10.1373/clinchem.2015.238717. Epub 2015 May 15.
 
Prospective blinded study of BRAFV600E mutation detection in cell-free DNA of patients with systemic histiocytic disorders. Hyman DM et al. Cancer Discov. 2015 Jan;5(1):64-71. doi: 10.1158/2159-8290.CD-14-0742. Epub 2014 Oct 16.
 
Metachronous pancreatic cancer originating from disseminated founder pancreatic intraductal neoplasias (PanINs). Imai K et al. J Pathol Clin Res. 2015 Feb 2;1(2):76-82. doi: 10.1002/cjp2.8. eCollection 2015.
 
Detection of K-ras gene mutation by liquid biopsy in patients with pancreatic cancer. Kinugasa H et al. Cancer. 2015 Jul 1;121(13):2271-80. doi: 10.1002/cncr.29364. Epub 2015 Mar 30.
 
Droplet digital PCR measurement of HER2 in patients with gastric cancer. Kinugasa H et al. Br J Cancer. 2015 May 12;112(10):1652-5. doi: 10.1038/bjc.2015.129. Epub 2015 Apr 21.
 
Brain tumor mutations detected in cerebral spinal fluid. Pan W et al. Clin Chem. 2015 Mar;61(3):514-22. doi: 10.1373/clinchem.2014.235457. Epub 2015 Jan 20.
 
Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery. Reinert T et al. Gut. 2016 Apr;65(4):625-34. doi: 10.1136/gutjnl-2014-308859. Epub 2015 Feb 4.
 
 
Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Siravegna G et al. Nat Med. 2015 Jul;21(7):795-801. doi: 10.1038/nm.3870. Epub 2015 Jun 1.
 
Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Thress KS et al. Nat Med. 2015 Jun;21(6):560-2. doi: 10.1038/nm.3854. Epub 2015 May 4.
 
 
Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in patients with EGFR wild-type lung cancer: when there is a target, there is a targeted drug. Zhou F et al. J Clin Oncol. 2015 Feb 10;33(5):523-4. doi: 10.1200/JCO.2014.57.5449. Epub 2015 Jan 12.
 
 
【2014】
Efficacy of intermittent combined RAF and MEK inhibition in a patient with concurrent BRAF- and NRAS-mutant malignancies. Abdel-Wahab O et al. Cancer Discov. 2014 May;4(5):538-45. doi: 10.1158/2159-8290.CD-13-1038. Epub 2014 Mar 3.
 
Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Oxnard GR et al. Clin Cancer Res. 2014 Mar 15;20(6):1698-705. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-2482. Epub 2014 Jan 15.
 
【2013】
EGFR mutation analysis in sputum of lung cancer patients: a multitechnique study. Hubers AJ et al. Lung Cancer. 2013 Oct;82(1):38-43. doi: 10.1016/j.lungcan.2013.07.011. Epub 2013 Aug 5.
 
キーワード: Biomarker Detection・ Liquid Biopsy
【2015】
Serial monitoring of circulating tumor DNA in patients with primary breast cancer for detection of occult metastatic disease. Olsson E et al. EMBO Mol Med. 2015 May 18;7(8):1034-47. doi: 10.15252/emmm.201404913.
 
【2014】
Noninvasive prenatal diagnosis in a fetus at risk for methylmalonic acidemia. Gu W et al. Genet Med. 2014 Jul;16(7):564-7. doi: 10.1038/gim.2013.194. Epub 2014 Jan 9.
 
【2013】
Low cerebrospinal fluid concentration of mitochondrial DNA in preclinical Alzheimer disease. Podlesniy P et al. Ann Neurol. 2013 Nov;74(5):655-68. doi: 10.1002/ana.23955. Epub 2013 Sep 4.
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