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技術情報

EGFR解析

2014/10/24 更新

EGFR関連解析サービスについて


 EGFRについては、以下の解析プラットフォームをご用意しております。

 EGFR以外の新規バイオマーカーの候補分子についても、解析手法を調査し、技術の導入、解析バリデーションを積極的に進めております。詳細は、電話またはメールにてお気軽にお問い合わせ下さい。

 

EGFRとは?


 EGFR:Epidermal Growth Factor Receptor (上皮増殖因子受容体)は、これまでの多くの研究によって正常の上皮細胞組織や、種々のがんにおいて発現していることが明らかになっています。また、EGFRはHERファミリーと呼ばれる4種のレセプター分子の一員であり、EGFR/HER1、2、3、4からなっています。これらのレセプター群は細胞膜を貫いた形で存在しており、血管新生誘導、細胞増殖促進、アポトーシス阻害などの作用に深く関与しています。

EGFR阻害剤とバイオマーカーについて


 EGFRタンパク質が過剰に発現する悪性腫瘍は予後不良を示し、またホルモン療法、化学療法、放射線療法において耐性を示すことが報告されています。そのため、EGFRは分子標的薬ターゲットとして注目され、チロシンキナーゼ部位を阻害する低分子薬(EGFR-TKI)として2002年にゲフィニチブ(イレッサ)が、2007年にエルロチニブ(タルセバ)が肺がん治療に承認されました。また、EGFRに特異的に結合する ことで下流のシグナル伝達を阻害し、抗腫瘍効果を示す抗体医薬としてセツキシマブ(アービタックス)が開発され、2008 年より「EGFR陽性の治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸がん」の治療薬として承認されました。セツキシマブ投与前にEGFRタンパク質発現の有無を検索することが必要であり、2008 年にEGFR検査が保険収載されました。弊社では、免疫組織化学(IHC)による検査を実施しております。

 近年、複数の基礎研究や臨床試験からEGFR分子そのものや、がん細胞の増殖シグナルに関与する遺伝子の変異が、EGFR-TKIの奏功性や耐性に関与していることが明らかになりました。例えば、肺がんにおいては、EGFR遺伝子変異が2004年に発見され、一部のEGFR遺伝子変異がEGFR-TKIの奏功性を向上させることが様々な臨床試験で証明され、2007年にEGFR遺伝子変異の検査が保険収載されました。また、上記のセツキシマブはKRAS遺伝子に変異を有する場合、その効果が低いことが大腸がんの臨床試験で証明されており、この遺伝子変異解析が保険収載されています。KRASはEGFRの増殖シグナルパスウェイの下流に位置し、変異型KRASは増殖シグナルのスイッチが常にONになるため、上流のEGFRのシグナルを止めてもがん細胞の増殖は抑制されないと考えられています。

 このように、がん関連遺伝子の変異検査がバイオマーカー解析手法としてすでに臨床の現場で用いられ始めています。

 

EGFR解析に関する文献のご紹介


血漿中DNAの変異/コピー数解析

Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients.

Yung TK, Chan KC, Mok TS, Tong J, To KF, Lo YM.
Clin Cancer Res. 2009 Mar 15;15(6):2076-84

 

 本研究では、新しい超高感度検出定量の技術であるdigital PCRを用いて肺がん患者の血液からEGFR遺伝子変異を検出しコピー数の定量を行いました。患者から切除した原発巣および採取した血漿から抽出したDNAを用いて検出・比較を行いました。その結果、原発巣がシークエンス法で変異陽性だった症例の92%で、digital PCRによって血漿から変異を検出することができました。また、従来のシークエンス法では変異が検出できなかった原発巣サンプルについても、digital PCRによって変異を検出することができました。さらに興味深いことに、EGFR-TKI(イレッサ、タルセバ)の投与前後の血漿中の変異型EGFRのコピー数をdigital PCRで測定した結果、EGFR-TKIによる治療効果に応じて変異型EGFRのコピー数が変動したことから、血漿中EGFR遺伝子変異のコピー数が治療効果の指標として利用できることが示唆されました。今後、非侵襲的なサンプルである血液サンプルからdigital PCRにより高感度にEGFR遺伝子変異を検出・コピー数定量を行うことにより、より簡便にかつ高精度に治療の奏功性や予後の予測ができるようになることが期待されます。

 

Abstract
Purpose: We aim to develop a digital PCR-based method for the quantitative detection of the two common epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations (in-frame deletion at exon 19 and L858R at exon 21) in the plasma and tumor tissues of patients suffering from non-small cell lung cancers. These two mutations account for >85% of clinically important EGFR mutations associated with responsiveness to tyrosine kinase inhibitors.
Experimental design: DNA samples were analyzed using a microfluidics system that simultaneously performed 9,180 PCRs at nanoliter scale. A single-mutant DNA molecule in a clinical specimen could be detected and the quantities of mutant and wild-type sequences were precisely determined.
Results: Exon 19 deletion and L858R mutation were detectable in 6 (17%) and 9 (26%) of 35 pretreatment plasma samples, respectively. When compared with the sequencing results of the tumor samples, the sensitivity and specificity of plasma EGFR mutation analysis were 92% and 100%, respectively. The plasma concentration of the mutant sequences correlated well with the clinical response. Decreased concentration was observed in all patients with partial or complete clinical remission, whereas persistence of mutation was observed in a patient with cancer progression. In one patient, tyrosine kinase inhibitor was stopped after an initial response and the tumor-associated EGFR mutation reemerged 4 weeks after stopping treatment.
Conclusion: The sensitive detection and accurate quantification of low abundance EGFR mutations in tumor tissues and plasma by microfluidics digital PCR would be useful for predicting treatment response, monitoring disease progression and early detection of treatment failure associated with acquired drug resistance.

 PMID 19276259

変異型EGFRの特異的免疫染色・1

Mutation-Specific Antibodies for the Detection of EGFR Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer

Yu J, Kane S, Wu J, Benedettini E, Li D, Reeves C, Innocenti G, Wetzel R, Crosby K, Becker A, Ferrante M, Cheung WC, Hong X, Chirieac LR, Sholl LM, Haack H, Smith BL, Polakiewicz RD, Tan Y, Gu TL, Loda M, Zhou X, Comb MJ
Cancer Res 2009;15 : 3023-3028

 本研究では、変異EGFRに対する抗体を作製し、その評価を行っています。EGFR変異のおよそ90%を占めると言われている2つの変異(exon19 del.、L858R変異)に対する抗体を作製し、あらかじめEGFR変異の情報が明らかな培養細胞やゼノグラフト組織サンプルを用いたウェスタンブロット、免疫組織蛍光染色、IHCによってその特異性を確認しました。さらにNSCLCの腫瘍組織のEGFR変異について、IHC法、シークエンス法およびMS-basedシークエンス法の解析結果を比較したところ、IHCで92%の感度と99%の特異性を示し、さらにシークエンス法よりも精度が高いことが示唆されました。今後、この抗体を用いた検査によりEGFR-TKIの奏功性予測検査が迅速・簡便・低コストで可能になることが期待できます。

Abstract
Purpose: Activating mutations within the tyrosine kinase domain of epidermal growth factor receptor (EGFR) are found in approximately10% to 20% of non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients and are associated with response to EGFR inhibitors. The most common NSCLC associated EGFR mutations are deletions in exon 19 and L858R mutation in exon 21, together accounting for9 0% of EGFR mutations. To develop a simple, sensitive, and reliable clinical assay forth e identification of EGFR mutations in NSCLC patients, we generated mutation-specific rabbit monoclonal antibodies against each of these two most common EGFR mutations and aimed to evaluate the detection of EGFR mutations in NSCLC patients by immunohistochemistry.
Experimental Design : We tested mutation-specific antibodies by Westernblot, immunofluorescence, and immunohistochemistry. In addition, we stained 40 EGFR genotyped NSCLC tumor samples by immunohistochemistry with these antibodies. Finally, with a panel of four antibodies, we screened a large set of NSCLC patient samples with unknown genotype and confirmed the immunohistochemistry results by DNA sequencing.
Results: These two antibodies specifically detect the corresponding mutant form of EGFR by Western blotting, immunofluorescence, and immunohistochemistry. Screening a panel of 340 paraffin-embedded NSCLC tumor samples with these antibodies showed that the sensitivity of the immunohistochemistry assay is 92%, with a specificity of 99% as compared with direct and mass spectrometry-based DNA sequencing.
Conclusions: This simple assay for detection of EGFR mutations in diagnostic human tissues provides a rapid, sensitive, specific, and cost-effective method to identify lung cancer patients responsive to EGFR-based therapies.

PMID 19366827

変異型EGFRの特異的免疫染色・2

Assessment of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma by immunohistochemistry using antibodies specific to the two major forms of mutant EGFR
Marie Brevet, Maria Arcila, Marc Ladanyi
J Mol Diagn. 2010 Mar;12(2):169-76

 下記の論文は、上記の論文の変異EGFRに対する抗体を用いたIHC法の詳細な解析報告です。218症例のパラフィン包埋肺がん組織を用いてシークエンス法とIHC法それぞれでEGFR変異同定を行うことでIHC法の評価を行いました。その結果、抗L858R抗体では感度76%、精度100%、抗19del抗体では感度67%、精度100%と高精度で変異を検出することができました。IHC法はシークエンス法と比べて短時間、低コストで結果を出すことができるため、EGFR変異型同定における最初のステップとしての多くのサンプルからのスクリーニングに非常に有効であり、今後の臨床利用が期待されます。

Abstract
EGFR mutations are the best predictors of response to EGFR kinase inhibitors in lung adenocarcinoma. We evaluated two mutation-specific monoclonal antibodies for the detection of EGFR mutations by immunohistochemistry (IHC), generated respectively against the L858R mutant and the exon 19 mutant with the common 15bp/5AA deletion. These two mutations account for approximately 90% of all EGFR mutations. IHC staining performed on 218 paraffin-embedded lung adenocarcinomas was assessed on a 0 to 3+ scale, and positivity cutoffs of 1+ and 2+ were compared. All cases were studied by standard molecular methods for these two mutations, and selected cases were also studied using higher sensitivity molecular assays. The EGFR L858R mutant antibody showed a sensitivity of 95% and a positive predictive value (PPV) of 99% with a positivity cutoff of 1+ and a sensitivity of 76% and a PPV of 100% with a positivity cutoff of 2+. The EGFR exon 19 mutant-specific antibody showed reduced sensitivity for exon 19 deletions other than 15bp. A positivity cutoff of 1+ resulted in a sensitivity of 85% and a PPV of 99%, whereas a 2+ cutoff gave a sensitivity of 67% and a PPV of 100%. IHC with EGFR mutant-specific antibodies could be used as a screen to identify most candidates for EGFR inhibitors.

PMID 20093391

(各文献の解釈につきましては、当社は一切の責任を負いません) 

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