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第44回　第3世代のPCR～デジタルPCR～ddPCRはここがすごい

2021/12/6　更新

　PCR増幅をリアルタイムで測定できるリアルタイムPCRの登場は、PCRを用いた核酸定量の認識を大きく変化させました。技術の進歩とともにデジタルPCRが登場し、以前、当コラムの第15回　デジタルPCRでデジタルPCRについてご紹介いたしました。当社でもデジタルPCRを用いたリアルタイムPCR受託サービスを提供しており多くのご注文をいただいておりますが、その中でも今回は液滴を使ったドロップレットデジタルPCR（Droplet Digital PCR：ddPCR）に焦点を当ててその特長をご紹介したいと思います。

＜ddPCRとは＞

　ddPCRは、低発現遺伝子の発現定量、微小なコピー数定量や変異解析など極めてわずかな差異を検出でき超高感度に絶対定量解析が可能な定量PCRです。ddPCRを用いた文献は2021年6月23日現在、5,900に及びます。
Bio-Rad社ウェブサイト：https://www.bio-rad.com/ddPCR/publications

　ddPCRはどのような原理なのでしょうか。簡単にご紹介いたします。

１．サンプル調製
DNAサンプル、プライマー・プローブ専用試薬を混合します。

２．ドロップレットの作成
カートリッジに調製したサンプルと専用オイルを分注すると、1サンプルあたり20,000個のドロップレットが生成されます。ターゲットDNA（■）とバックグラウンドDNA（■）がランダムに各ドロップレット内に分散する状態となります。

３．PCR反応
２で作成したドロップレットのPCR増幅を行います。それぞれのドロップレットで独立してPCR増幅が行われます。

４．ドロップレットの蛍光測定
各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し、positiveまたはnegativeなドロップレットの数をカウントします。PCR増幅のかかったポジティブドロップレットを直接カウントすることによって、正確な絶対定量が可能となります。専用ソフトウェアを使用し各サンプルの濃度（copy/uL）を算出します。

　以上から、ddPCRのメリットをまとめてみると、
① 検量線を用いず絶対定量が可能
→サンプル中のターゲットDNAコピー数を、検量線を用いずに絶対定量で検出
② 超高感度・高精度検出が可能
→ポジティブな微小区画数を直接カウントするため定量精度が高い
③ PCRの増幅効率に左右されない
→エンドポイント測定のためPCR阻害等による影響を受けづらい
④ 検出することが難しい遺伝子の微量な変化などのモニタリングが可能
→1.1倍の希釈系列を絶対定量可能であるため、わずかなコピー数の違いも識別
⑤ 2種類の色素を同時に検出可能
→野生型と変異型など2種を同時に定量することで変異比率などを算出できる